本發(fā)明涉及紅光熒光染料合成的，尤其涉及一類側(cè)鏈修飾的五甲川花菁染料、其合成方法及應用。
背景技術：
1、光動力治療作為一種非侵入、周期短、不產(chǎn)生耐藥的新型治療方法，已被應用于某些疾病的臨床治療。而利用有機染料的熒光特性和電子轉(zhuǎn)移性質(zhì)，可以對病變組織進行熒光成像和精準光動力治療，從而實現(xiàn)對疾病的診療一體化的目的。因此，研究人員開發(fā)出了許多有機染料作為光敏劑用于疾病的診療，目前最常見的是bodipy類染料和釕配合物等，但是這類染料普遍吸收和發(fā)射波長較短，并且不具備對細胞器的靶向作用，難以實現(xiàn)對體內(nèi)深層疾病的精確診斷和治療。由于實體瘤內(nèi)嚴重的缺氧微環(huán)境限制這光敏劑的使用，在應對乏氧腫瘤治療難題上，生成超氧陰離子自由基或羥基自由基為主要活性氧的i型光動力治療展現(xiàn)更好的優(yōu)勢和應用潛力。然而，現(xiàn)有的臨床用光敏劑大都為以生成單線態(tài)氧為主要活性氧的ii型占主導的光敏化模式，i型光敏劑相對比較缺乏。
2、五甲川花菁染料作為經(jīng)典菁染料體系，其光物理性質(zhì)與應用研究已較為深入。該系列化合物在紅光區(qū)(600-750nm)呈現(xiàn)特征性吸收與發(fā)射光譜，兼具高摩爾消光系數(shù)(ε>10^5l·mol-1·cm-1)及優(yōu)異熒光量子產(chǎn)率(φf≈0.2-0.5)，已成功應用于生物熒光標記與組織染色領域。然而，該類染料受激后主要通過非輻射躍遷與熒光發(fā)射途徑釋放能量，導致其系間竄越效率較低，難以實現(xiàn)有效光動力治療所需的光敏化電子轉(zhuǎn)移過程?，F(xiàn)有改性策略主要基于重原子效應(如碘/溴取代)，但該途徑存在顯著局限性：①引入重原子導致分子極性降低(logp值增加2-3個單位)，顯著影響其水溶性(<0.1mg/ml)；②細胞毒性顯著增強(ic50值降低約2個數(shù)量級)；③復雜取代基的引入使合成路線延長(平均增加3-5步反應)，且異構體分離效率下降(hplc純度<85％)。上述缺陷嚴重制約其生物醫(yī)學轉(zhuǎn)化潛力。
3、因此，針對當前ii型光敏劑在腫瘤乏氧微環(huán)境中單線態(tài)氧生成效率驟降的固有缺陷，亟需通過分子工程策略開發(fā)新型五甲川基i型光敏劑。在維持其固有紅光(650-700nm)吸收和發(fā)射特性的基礎上，構建具有可控電子轉(zhuǎn)移路徑的光敏體系，使其通過電子轉(zhuǎn)移機制產(chǎn)生超氧陰離子自由基、羥基自由基等長壽命活性氧物種，從而突破腫瘤微環(huán)境對傳統(tǒng)光動力療效的限制。
技術實現(xiàn)思路
1、針對現(xiàn)有技術存在的現(xiàn)有五甲川花菁染料無法發(fā)生高效的電子轉(zhuǎn)移產(chǎn)生超氧陰離子自由基的問題，本發(fā)明的第一個目的在于提供一類側(cè)鏈修飾的五甲川花菁染料的合成方法及其應用，所述五甲川花菁染料，具有紅光激發(fā)、線粒體定位和良好i型光動力效果。
2、本發(fā)明的第二個目的在于提供一類側(cè)鏈修飾的五甲川花菁染料的合成方法，所述制備方法具有合成方法簡單，原料廉價，產(chǎn)率高，普適性高的優(yōu)點。
3、本發(fā)明的第三個目的在于提供一類側(cè)鏈修飾的五甲川花菁染料的應用，所述側(cè)鏈修飾的五甲川花菁染料能夠作為染料，在光催化領域引發(fā)化學反應、光動力領域生成活性氧。
4、為實現(xiàn)上述第一個目的，本發(fā)明提供了如下技術方案：一類側(cè)鏈修飾的五甲川花菁染料，包括以下通式cy5-r：
5、
6、其中，r1和r2各自獨立的選自氫、1-6個碳的烷基、具有1-6個碳的羧烷基、芳乙基、2-(噻吩-2-基)乙基、2-(5-(甲硫基)噻吩-2-基)乙基、2-(聯(lián)噻吩-2-基)乙基、2-(噻吩并[3,2-b]噻吩-2-基)乙基、2-([2,2'：5'，2'-三噻吩]-5-基)乙基及其衍生物中的任意一種，優(yōu)選的，r1和r2選自芳乙基、2-(噻吩-2-基)乙基、2-(5-(甲硫基)噻吩-2-基)乙基、2-(聯(lián)噻吩-2-基)乙基、2-(噻吩并[3,2-b]噻吩-2-基)乙基、2-([2,2'：5'，2'-三噻吩]-5-基)乙基及其衍生物中的任意一種；
7、r3和r4是苯環(huán)不確定位置的取代基，各自獨立的選自氫、鹵素、甲氧基、氨基、硝基、羥基、羧基中的任意一種，優(yōu)選的，r3和r4是在苯環(huán)上的取代位置優(yōu)選為5位取代，各自獨立的選自氫、鹵素、甲氧基、硝基的任意一種。
8、y-選自無機負離子或有機負離子：鹵素離子、clo4-、bf4-、pf6-、ch3coo-、cf3coo-或ots-的任意一種，優(yōu)選的，y-選自鹵素離子、clo4-、pf6-的任意一種。
9、進一步地，所述側(cè)鏈修飾的五甲川花菁染料的發(fā)射波長在650nm以上。實施例1-5中使用的發(fā)射波長為650-720nm。
10、通過采用上述技術方案：由于染料的最大發(fā)射波長均在650nm以上，可以作為紅光區(qū)域發(fā)光材料。最大發(fā)射波長在650-720nm范圍內(nèi)，適用于深層組織成像；吸收和發(fā)射波長均在紅光區(qū)域；線粒體靶向定位能力，與線粒體探針的共定位系數(shù)高達0.860。
11、為實現(xiàn)上述第二個目的，本發(fā)明提供了如下技術方案：一類側(cè)鏈修飾的五甲川花菁染料，包括：
12、
13、⑴季銨鹽h-1、h-2的合成：
14、將帶有r3取代基修飾的苯并吲哚j-1與6-溴己酸混合均勻，然后加入第一有機溶劑，在40-120℃下反應4-12h，得到季銨鹽h-1；
15、將帶有r4取代基修飾的苯并吲哚j-2與6-溴己酸混合均勻，然后加入第二有機溶劑，在40-120℃下反應4-12h，得到季銨鹽h-2；
16、⑵化合物h-3的合成：
17、將季銨鹽h-1、h-2和縮合劑j-3混合均勻，然后加入第三有機溶劑和無機堿，在50-150℃下反應4-12h，除去溶劑，得到目標產(chǎn)物。
18、⑶化合物h-4的合成：
19、將化合物h-3與帶有r1取代基的相應的醇混合均勻，然后加入第四有機溶劑和有機堿i，加入催化劑i，在25-50℃下反應4-12h，除去溶劑，柱層析，得到目標產(chǎn)物。
20、⑷化合物h-5的合成：
21、將化合物h-4與帶有r2取代基的相應的醇混合均勻，然后加入第五有機溶劑和有機堿ii，加入催化劑ii，在25-50℃下反應4-12h，除去溶劑，柱層析，得到目標產(chǎn)物。
22、對于上文所述的技術方案而言，進一步優(yōu)選的，上述步驟⑴中，第一有機溶劑或第二有機溶劑各自獨立的選自乙醇、乙腈、甲苯、n,n-二甲基甲酰胺、鄰二氯苯、環(huán)丁砜中的至少一種；
23、對于上文所述的技術方案而言，進一步優(yōu)選的，上述步驟⑴中，所述苯并吲哚、6-溴己酸、第一或第二有機溶劑的摩爾比為1:1-8:8-20，更進一步優(yōu)選比例為1:1-3:8-12；最優(yōu)選的摩爾比為1:2:10；
24、對于上文所述的技術方案而言，進一步優(yōu)選的，上述步驟⑴中，所述反應溫度為60-100℃，反應時間為6-10h。
25、對于上文所述的技術方案而言，進一步優(yōu)選的，上述步驟⑵中，第三有機溶劑選自乙醇、乙酸酐、正丁醇、異丙醇、乙酸中的至少一種，無機堿選自碳酸鉀、碳酸鈉、乙酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸銫、氫氧化鉀、氫氧化鈉、叔丁醇鈉中的一種；
26、對于上文所述的技術方案而言，進一步優(yōu)選的，步驟⑵中，所述季銨鹽h-1、h-2、縮合劑j-3、第三有機溶劑、無機堿的摩爾比為1-4:1-4:1:8-20:1-5，更進一步優(yōu)選比例為1-2:1-2:1:8-15:1-3；最優(yōu)選的摩爾比為1:1:1:10:2；
27、對于上文所述的技術方案而言，進一步優(yōu)選的，步驟⑵中，反應溫度為60-100℃，反應時間為6-10h。
28、對于上文所述的技術方案而言，進一步優(yōu)選的，上述步驟⑶中，第四有機溶劑選自二氯甲烷、n,n-二甲基甲酰胺、1,2-二氯乙烷、乙腈、甲苯中的至少一種，有機堿i選自三乙胺、吡啶、n,n-二異丙基乙胺中的一種，催化劑i選自dcc、edc-hcl、hatu、hbtu、hctu、tntu、tstu中的一種；
29、對于上文所述的技術方案而言，更進一步優(yōu)選的，上述步驟⑶中，化合物h-3、帶有r1取代基的相應的醇、催化劑i、有機堿i、第四有機溶劑的摩爾比為1:1-4:1-4:1-5:8-20；
30、對于上文所述的技術方案而言，更進一步優(yōu)選的，上述步驟⑶中，摩爾比為1:1-2:2-3:4-5:8-12；最優(yōu)選的摩爾比為1:1:2.5:3:10；
31、對于上文所述的技術方案而言，更進一步優(yōu)選的，上述步驟⑶中，反應溫度為25-35℃，反應時間為6-10h。
32、對于上文所述的技術方案而言，進一步優(yōu)選的，上述步驟⑷中，第五有機溶劑選自二氯甲烷、n,n-二甲基甲酰胺、1,2-二氯乙烷、乙腈、甲苯中的至少一種，有機堿ii選自三乙胺、吡啶、n,n-二異丙基乙胺中的一種，催化劑ii選自dcc、edc-hcl、hatu、hbtu、hctu、tntu、tstu中的一種；
33、對于上文所述的技術方案而言，更進一步優(yōu)選的，上述步驟⑷中，化合物h-4、帶有r2取代基的相應的醇、催化劑ii、有機堿ii、第五有機溶劑的摩爾比為1:1-4:1-4:1-5:8-20，更進一步優(yōu)選的摩爾比為1:1-2:1-3:2-3:8-12；最優(yōu)選的摩爾比為1:1.5:1.5:3:10；
34、對于上文所述的技術方案而言，更進一步優(yōu)選的，上述步驟⑷中，反應溫度為25-35℃，反應時間為6-10h；
35、為實現(xiàn)上述第三個目的，本發(fā)明其特征在于，所述側(cè)鏈修飾的五甲川花菁染料具有優(yōu)異的紅光激發(fā)特性、高效的電子轉(zhuǎn)移能力和低暗毒性，使其在生物醫(yī)學和能源領域展現(xiàn)出巨大的潛力?？梢詰糜诠獯呋I域、作為紅光區(qū)域發(fā)光材料、生物標記探針、用于光動力治療的制劑、光解水制氫以及生物傳感領域。
36、更進一步地，所述側(cè)鏈修飾的五甲川花菁能夠作為光敏劑，在光催化領域引發(fā)化學反應、光動力領域生成活性氧、磷光材料領域產(chǎn)生磷光信號。
37、更進一步地，所述側(cè)鏈修飾的五甲川花菁的光信號在紅光系統(tǒng)中尤為突出，該系列染料的最大發(fā)射波長均在680nm以上，具有優(yōu)異的組織穿透性和深層成像能力，可以作為紅光區(qū)域發(fā)光材料，特別適用于深層組織的熒光成像和光動力治療。
38、更進一步地，所述側(cè)鏈修飾的五甲川花菁分子能夠快速高效穿過細胞膜，進入細胞中并富集到亞細胞器內(nèi)，通過低光密度的紅光照射，高效產(chǎn)生活性氧物質(zhì)，破壞細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡，在低至納摩爾級別高效率殺傷癌癥細胞，可以應用于光動力治療領域，同時具有低暗毒性和高選擇性，能夠?qū)崿F(xiàn)診療一體化。
39、與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下有益效果：
40、第一、本發(fā)明所述的側(cè)鏈修飾的五甲川花菁分子，通過對五甲川花菁分子側(cè)鏈進行修飾，使其在有機溶劑中具有良好的摩爾消光系數(shù)和熒光量子產(chǎn)率。
41、第二、本發(fā)明所述的側(cè)鏈修飾的五甲川花菁染料，具有很好的電子轉(zhuǎn)移能力，在體外與對比例相比，可產(chǎn)生較多的超氧陰離子自由基。適用于光動力治療。通過dhr123熒光探針測試，本發(fā)明的染料在光照后熒光強度顯著增強，表明其能夠高效生成超氧陰離子自由基。與對比例1相比，實施例1-5的超氧陰離子自由基生成量顯著增加，且隨著側(cè)鏈修飾基團電子云密度的增強，自由基生成量逐步增多。這種高效的電子轉(zhuǎn)移能力使其在光動力治療中表現(xiàn)出優(yōu)異的活性氧生成效果。
42、第三、本發(fā)明所述的側(cè)鏈修飾的五甲川花菁染料，可以快速的穿過細胞膜，在細胞線粒體富集，可以利用細胞線粒體的變化檢測生理學過程，能夠?qū)崿F(xiàn)對細胞器的靶向成像和治療。通過共聚焦顯微鏡成像，本發(fā)明的染料與線粒體綠色熒光探針的共定位系數(shù)高達0.860，表明其能夠定位于細胞線粒體。實施例5在無光照條件下對4t1細胞的暗毒性較低，細胞存活率高于90％；而在660nm光照20min后，其光毒性呈現(xiàn)劑量依賴性變化，半數(shù)抑制率(ic50)為0.15μm，顯著優(yōu)于對比例1。這種低暗毒性和高選擇性使其能夠?qū)崿F(xiàn)診療一體化。
43、第四、本發(fā)明所述的側(cè)鏈修飾的五甲川花菁染料，在無光照條件下對細胞毒性較低，在光照后產(chǎn)生大量超氧陰離子自由基，造成細胞的死亡，實現(xiàn)光動力治療的目的。通過mtt實驗，本發(fā)明的染料在無光照條件下對細胞毒性較低，光照后能夠高效殺傷癌細胞，ic50為0.15μm。這種高效的光動力治療效果使其在腫瘤治療中具有重要的應用價值。
44、第五、本發(fā)明所述的側(cè)鏈修飾的五甲川花菁染料在650nm以上具有強吸收和發(fā)射特性，能夠穿透深層組織，適用于深層腫瘤的熒光成像和光動力治療。通過紫外可見吸收光譜和熒光發(fā)射光譜測試，本發(fā)明的染料在650-720nm范圍內(nèi)表現(xiàn)出強吸收和發(fā)射特性。這種紅光激發(fā)特性使其具有優(yōu)異的組織穿透能力，特別適用于深層腫瘤的熒光成像和光動力治療。
45、第六、本發(fā)明的合成方法包括季銨鹽合成、縮合反應及側(cè)鏈修飾等步驟，具有原料廉價、產(chǎn)率高、操作簡便的特點。實施例1-5的合成步驟中，各中間體及目標產(chǎn)物的收率均高于45％，最高可達90.25％。這種高效的合成方法為其大規(guī)模生產(chǎn)和應用提供了技術保障。