一種快速檢測甘蔗屬spsb基因多態(tài)性的方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物分子育種技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測甘蔗SPSB基因 （JN 584485)多態(tài)性的方法，及其在甘蔗糖分性狀的標(biāo)記輔助選擇育種中快速建立遺傳優(yōu)良的 甘蔗種質(zhì)的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 甘鹿屬（Saccharum)包含熱帶種（Saccharum. officinarum L.)、中國種 (Saccharum sinense R·)、印度種（Saccharum barberi J·)、甘鹿大莖野生種（Saccharum robustum B.)和甘鹿細(xì)莖野生種（Saccharum spontaneum L·)，是甘鹿雜交育種中常用的 甘蔗資源，染色體復(fù)雜多變，多為異源多倍體植物，細(xì)胞核內(nèi)含有多套染色體組。因此雜交 后代的性狀分離嚴(yán)重，一個雜交花穗的后代有成百上千后代類型，不能精確各單倍型在后 代的傳遞方式。蔗糖磷酸合成酶（SPS)是甘蔗蔗糖合成最關(guān)鍵的酶之一，鑒定和分離出不 同多態(tài)性的SPS基因?qū)Ω收岬亩ㄏ螂s交與提高甘蔗蔗糖分具有重要的意義。目前，我國甘 蔗育種還基本上以傳統(tǒng)的雜交為主，從不同的雜交組合中選出性狀優(yōu)良的，高產(chǎn)高糖的品 種。但這一方式耗費時間長，育成一個品種至少需要6年以上的時間，而且在選配雜交組合 時僅從表型性狀來選擇父母本，加上甘蔗開花條件的限制，育成一個新品種的難度很大，因 此如何從分子水平來指導(dǎo)甘蔗的品種選育成為育種家們關(guān)注的焦點。
[0003] 甘蔗是我國重要的糖料作物，提高單位面積內(nèi)甘蔗產(chǎn)量是甘蔗育種家們一直追求 的目標(biāo)。蔗糖磷酸合成酶是甘蔗蔗糖合成最密切的關(guān)鍵酶之一，共有4個家族，它是甘蔗體 內(nèi)光合產(chǎn)物向蔗糖和淀粉分配的關(guān)鍵調(diào)控點，在該酶的作用下，不可逆性的催化六磷酸果 糖生成六磷酸蔗糖，此產(chǎn)物在蔗糖磷酸酯酶的作用下形成蔗糖，與蔗糖的合成呈正相關(guān)，對 甘蔗蔗糖含量的增加具有重要的作用。因此，分析SPS基因遺傳變異特別是多態(tài)位點與甘 蔗糖分性狀的關(guān)聯(lián)程度，對培育具有優(yōu)良性狀的甘蔗新品種和提高育種速度具有重要的理 論指導(dǎo)意義。
[0004] 目前國內(nèi)外在甘蔗SPSB基因的克隆和功能方面的研宄較多，主要從mRNA的角度 來進(jìn)行研宄，但該基因的內(nèi)含子區(qū)域并沒有得到完整的克隆，其內(nèi)含子區(qū)域的多態(tài)性分析 也未見報道。雖然內(nèi)含子不能決定基因的表達(dá)功能，但內(nèi)含子的多態(tài)性可以區(qū)分不同倍性 的SPS基因及其來源。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明解決的問題在于利用甘蔗屬不同種基因組DNA來篩查SPSB基因的多態(tài)性， 尋找插入性片段作為PCR檢測的位點，從而提供一種快速檢測甘蔗屬SPSB基因多態(tài)性的方 法，并以此作為甘蔗多態(tài)性的標(biāo)記，為不同SPSB基因型的甘蔗雜交育種提供一定的指導(dǎo)。
[0006] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
[0007] -種快速檢測甘蔗屬SPSB基因多態(tài)性的方法，其特征在于，設(shè)計一對引物 SPSB2177P2擴(kuò)增含多態(tài)的DNA片段，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，依據(jù)獲得的電泳圖譜條帶類 型判斷SPSB基因多態(tài)類型，
[0008] 包括如下步驟：
[0009] 步驟（1)，模板的制備：提取被測樣本的基因組DNA ;
[0010] 步驟（2)，引物設(shè)計：所述的引物對SPSB2177P2為：
[0011] 上游引物：5 ' - TGACGACAATAAGGAGAAGAA - 3 '
[0012] 下游引物：5 ' - CAAAGGAACAGCTAGTGAAAC - 3 '
[0013] 步驟（3)，PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳檢測；
[0014] 步驟（4)，基因型的判斷；
[0015] 步驟（5)，SPSB基因多態(tài)結(jié)果鑒定。
[0016] 上述技術(shù)方案中，所述的模板為甘蔗屬大莖野生種51NG3、印度種Nagori、甘蔗品 種R0C22、熱帶種Badila、中國種光澤竹蔗和甘蔗細(xì)莖野生種印割1號的DNA。
[0017] 上述技術(shù)方案中，所述的PCR擴(kuò)增體系為：
[0018] Buffer fT Mg2+, 2 5pL dNTP 2.5mM 2μ!_ EasyTaq DNA 聚介酚 0.5μ!_ 上游引物IOuM 0.5μ!_ 下游引物IOuM 0.5μ!_ DNA 模板 40ng/p L 1.5μ!_ ddH20 17·5μ!_ 總體積 25μ!_。
[0019] 上述技術(shù)方案中，所述的擴(kuò)增程序為94°C預(yù)變性5min ;35個循環(huán)94°C變性30s， 55°C 退火 30s，72°C延伸 45s ;72°C延伸 7min。
[0020] 所述的瓊脂糖凝膠電泳檢測的具體方法如下：配2.5% (w/v)瓊脂糖凝膠，取5yL 擴(kuò)增的產(chǎn)物與2 μ LLoading buffer混勾后上樣，140V下電泳30min，紫外判斷PCR結(jié)果。具 體結(jié)果如圖1所示，甘鹿栽培種R0C22、熱帶種Badila、中國種光澤竹鹿、印度種Nagori和 大莖野生種51NG3同時含有Cl和C2型，而甘蔗細(xì)莖野生種印割1號僅含有Cl型，表現(xiàn)為 C2缺失型。
[0021] 上述技術(shù)方案中，所述的基因型的判斷的具體方法為：根據(jù)步驟（3)電泳檢測的 結(jié)果，所設(shè)計的引物特異性好，僅能擴(kuò)增出287bp和331bp的片段。當(dāng)出現(xiàn)大小為287bp片 段，為未插入性片段，則該SPSB基因型命名為Cl型；當(dāng)出現(xiàn)大小為331bp片段，為插入性片 段，則該SPSB基因型命名為C2型。
[0022] 上述技術(shù)方案中，所述的SPSB基因多態(tài)結(jié)果鑒定采用測序驗證。Cl型和C2型的 測序圖如圖2和圖3所示。
[0023] 上述技術(shù)方案中，所述的Cl型與C2型的差別在于C2型插入了一段44bp的序列， 該序列如SEQ ID NO. 5所示。通過Cl型和C2型測序序列的比對，證明Cl和C2型兩端序列 完全一致，與甘蔗SPSB基因第一內(nèi)含子序列完全相同，僅C2型序列多出一段插入性序列， 如圖4所示。
[0024] 本發(fā)明的研宄過程：
[0025] 以甘蔗大莖野生種51NG3、印度種Nagori、甘蔗品種ROC22、熱帶種Badila、中國 種光澤竹蔗和甘蔗細(xì)莖野生種印割1號的基因組DNA為模板，設(shè)計SPSB2177引物，引物上 下游序列分別在甘蔗SPSB基因第一外顯子和第二外顯子上，PCR擴(kuò)增甘蔗SPSB基因片段， 經(jīng)測序篩選出SPSB基因在第一內(nèi)含子1692bp處有一插入片段，引物兩端序列與SPSB基因 ⑶S序列完全相同，針對這一插入性片段的兩端設(shè)計引物SPSB2177P2,再以基因組DNA為模 板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠檢測，依據(jù)片段的大小分離多態(tài)性片段，將大小為287bp片 段的SPSB基因型命名為Cl型（未插入性片段），將大小為331bp片段的SPSB基因型命名 為C2型（插入性片段），兩段序列經(jīng)瓊脂糖凝膠回收、T載體連接和克隆測序，證明兩段序 列是SPS2177引物擴(kuò)增的多態(tài)性片段序列。
[0026] 所述的引物SPSB2177序列為：
[0027] 上游引物：5 ' - AACTTCAACCCCTCGCACTACTT - 3 '
[0028] 下游引物：5 ' - GTCCCCACTGTTCATCAATCTCC - 3 '
[0029] 5?382177:94°0預(yù)變性51^11;35個循環(huán)94°0變性3〇8,62°0退火3〇8,72°0延伸 2min ;72°C延伸 lOmin。
[0030] 所述的引物SPSB2177P2序列為：
[0031] 上游引物：5 ' - TGACGACAATAAGGAGAAGAA - 3 '
[0032] 下游引物：5 ' - CAAAGGAACAGCTAGTGAAAC - 3 '<