一種同時測定人環(huán)孢素作用靶點基因多態(tài)性的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種同時測定環(huán)孢素（Cyclosporine， CsA)作用祀點通路系列蛋白編碼基因多個單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP)位點基因型的方法，即一種同時測定人環(huán)孢素作用革El點基因多態(tài)性的 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 環(huán)孢素治療窗窄，療效存在顯著個體差異，目前，臨床上通常通過對其進行治療藥 物監(jiān)測（therapeutic drug monitoring，TDM)，即監(jiān)測血藥濃度，以調(diào)整環(huán)孢素的劑量。但 傳統(tǒng)的TDM難以從藥效學(xué)的角度反映個體之間的變異，而且TDM只有在服藥后方可實施，無 法在服藥前預(yù)測機體對藥物的反應(yīng)，藥物的初始劑量難以確定。因此，單純依靠 TDM來進行 環(huán)孢素的個體化治療顯然是不夠的，迫切需要尋找新的個體化治療策略。
[0003] 現(xiàn)有技術(shù)公開了遺傳變異是導(dǎo)致藥物效應(yīng)個體間變異的最主要因素之一。通過研 宄遺傳變異與藥物反應(yīng)的關(guān)系，可以根據(jù)基因型制定藥物的初始劑量，也可以篩選藥物反 應(yīng)敏感或無效的特定人群，進行個體化治療，藥物基因組學(xué)是個體化藥物治療發(fā)展的新臺 階。到2014年8月，F(xiàn)DA已經(jīng)批準或修訂138種藥物說明書，建議檢測基因型，以提高藥物 使用的有效性和安全性。
[0004] 藥物基因組學(xué)研宄涉及藥動學(xué)和藥效學(xué)相關(guān)基因的遺傳多態(tài)性。目前環(huán)孢素在 體內(nèi)的作用靶點和通路已經(jīng)明確。環(huán)孢素進入T細胞后與一種免疫親和素一親環(huán)蛋白 (Cyclophilin，CyP)相結(jié)合，CyP-CsA復(fù)合物會專一1性地結(jié)合以及抑制胞衆(zhòng)內(nèi)媽調(diào)磷酸酶 (calcineurin，CaN)，活性，阻斷活化 T 細胞核轉(zhuǎn)錄因子（nuclear factor of activated T cell，NFAT)的去磷酸化，進而抑制IL-2的基因轉(zhuǎn)錄，從而抑制T細胞的后續(xù)活化。在環(huán)孢 素作用信號通路的重要分子（CyP、CaN及NFAT)的功能狀態(tài)，對于環(huán)孢素藥理作用的發(fā)揮， 起到至關(guān)重要的作用。環(huán)孢素作用靶點信號通路中的CyP、CaN及NFAT的編碼基因單核苷 酸多態(tài)性，影響基因功能，進而影響環(huán)孢素與CyP、CyP與CaN、CaN與NFAT、以及NFAT與靶 基因的相互結(jié)合，從而最終影響環(huán)孢素的免疫抑制作用。
[0005] CyP屬于免疫親和素的一個亞類，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)其編碼基因為PPIA。CaN以異二聚體 的形式存在，由61ku的催化亞基Calcineurin A(CNA)和19ku的調(diào)節(jié)亞基Calcineurin B(CNB)組成。CNA有三個亞型，CNAa ΧΝΑβ和CNAy，其編碼基因分別為PPP3CA、PPP3CB和 PPP3CC。CNB有兩個亞型，分別是CNBl和CNB2,其編碼基因分別是PPP3R1和PPP3R2。其中 CNAa ΧΝΑβ及CNBl在體內(nèi)廣泛表達，而CNAy和CNB 2則只存在于大腦和睪丸中。NFAT 是屬于Rel蛋白家族，Rel蛋白家族包括NF-kB及NFAT，是保守的DNA結(jié)合域。NFAT有5種 亞型，分別是 NFATC1、NFATC2、NFATC3、NFATC4、NFAT5。其中 NFATC1、NFATC2、NFATC3 主要 存在于T淋巴細胞等免疫細胞中，NFATC4存在于包括心臟在內(nèi)的其他組織細胞中。NFAT5， 不同于其他4種蛋白，不受細胞內(nèi)鈣離子濃度的調(diào)節(jié)，主要通過激活高滲誘導(dǎo)的腫瘤壞死 因子（TNF)基因轉(zhuǎn)錄，參與T細胞生長、發(fā)育的調(diào)節(jié)。CaN-NFAT信號通路在免疫系統(tǒng)與非免 疫系統(tǒng)中，都發(fā)揮了重要的作用。CyPXaN及NFAT的編碼基因都有單核苷酸多態(tài)性。綜上 所述，檢測環(huán)孢素靶點通路基因的遺傳變異對預(yù)測環(huán)孢素藥物反應(yīng)有較重要的臨床意義。
[0006] 藥物在體內(nèi)最終效應(yīng)的發(fā)揮，受到多個環(huán)節(jié)的影響，包括藥動學(xué)和藥效學(xué)環(huán)節(jié)。而 藥動學(xué)和藥效學(xué)又各自收到多種酶、轉(zhuǎn)運蛋白、受體、信號通路等的影響。而每種受體、蛋白 等的編碼基因，又存在多個SNP位點。因此，僅僅檢測一種基因的一個SNP位點的基因型， 對解釋藥物的個體差異，顯然是遠遠不夠的。因此，往往需要同時檢測多個基因多個SNP位 點。
[0007] 目前，基因多態(tài)性的檢測方法主要有DNA直接測序法和Taqman探針法等。所述DNA 直接測序法是突變檢測的金標準，但存在費時費力，成本較昂貴等缺陷，是一種低通量的檢 測方法，不適用于對大量樣本進行檢測。所述Taqman是高度特異的定量PCR技術(shù)，其特點 是適應(yīng)于大樣本少量SNP位點檢測，是一種中等通量的SNP檢測，而對于同時檢測多個SNP 位點，則費用較高，不適宜。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 為解決現(xiàn)有技術(shù)中的上述問題，本發(fā)明提供一種高效、靈敏、準確的，能同時檢測 多個SNP位點的方法，即一種同時測定環(huán)孢素作用靶點通路系列蛋白編碼基因多個SNP位 點基因型的方法，適應(yīng)于大樣本或小樣本，以進一步為協(xié)助環(huán)孢素個體化給藥、保證用藥安 全和有效提供技術(shù)支撐。
[0009] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提出的技術(shù)方案為：
[0010] 一種同時測定人環(huán)孢素作用靶點基因多態(tài)性的方法，包括下列步驟：
[0011] 步驟1 :提取外周血細胞樣本的基因組DNA，針對目的基因不同的突變位點設(shè)計篩 選引物；并組合成不同的PCR反應(yīng)體系進行多重PCR反應(yīng)；
[0012] 步驟2 :擴增的PCR產(chǎn)物SAP處理后，進行單堿基延伸反應(yīng)；
[0013] 步驟3 :進行芯片點樣后，用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜進行檢測；
[0014] 步驟4 :使用軟件分析檢測結(jié)果，獲得分型數(shù)據(jù)。
[0015] 為優(yōu)化上述技術(shù)方案，本發(fā)明采取的措施還包括：
[0016] 上述步驟1中使用DNA提取試劑盒提取基因組DNA，并將提取的DNA濃度調(diào)整為 10-100ng/ul〇
[0017] 上述PCR反應(yīng)程序為：94°C 15min，45個循環(huán)（94°C 20sec，56°C 30sec，72°C lmin)， 72°C 3min〇
[0018] 上述 SAP 反應(yīng)程序為：37°C 40min，85°C 5min。
[0019] 上述單堿基延伸反應(yīng)條件為：94°C 30sec，40個循環(huán)[94°C 5sec，5個小循環(huán) (52°C 5sec，80°C 5sec)]，72°C 3min〇
[0020] 上述步驟2和步驟3之間還具有產(chǎn)物純化的步驟，產(chǎn)物純化的操作為：
[0021] (1)取樹脂在樹脂刮板上均勻覆蓋，放置20min ;
[0022] (2)將步驟2中反應(yīng)結(jié)束的孔板1000 rpm離心lmin，每孔加入25 μ L去離子水，倒 置在樹脂板上面，然后反置將樹脂板扣在孔板上，敲擊使樹脂落入孔板，封膜；
[0023] (3)翻轉(zhuǎn)孔板 20 分鐘，3500rpm、離心 5min。
[0024] 本發(fā)明的方法能高效、靈敏、準確的同時檢測環(huán)孢素作用靶點信號通路中的多個 蛋白編碼基因中的多個SNP位點的基因型，為解釋臨床環(huán)孢素藥效的個體差異提供重要依 據(jù)，指導(dǎo)環(huán)孢素的臨床個體化給藥。
[0025] 本發(fā)明采用時間飛行質(zhì)譜（MALDI-T0F)方法，其技術(shù)原理為首先通過PCR擴增含 有SNP的基因組片段，然后通過序列特異性引物實現(xiàn)單堿基延伸，隨后樣品分析物與芯片 基質(zhì)共結(jié)晶后在真空管中受瞬時納秒（l〇-9s)強激光激發(fā)。核酸分子因此解吸附成為單電 荷離子，由于電場中離子飛行時間與離子質(zhì)量成反比，通過檢測核酸分子在真空管中的飛 行時間而獲得樣品分析物的精確分子量，從而檢測出SNP位點信息。因此，該方法適用于同 時檢測同一樣本多個SNP位點。
[0026] 本發(fā)明所述方法操作簡便、無需序列特異性探針，一張芯片可對384個樣本進行 多重檢測，每個體系最多可實現(xiàn)40重反應(yīng)，同時檢測40個SNP位點，通量可根據(jù)要求進行 個性化調(diào)整，高通量，適用范圍廣，幾十到成千上萬個樣本，同時檢測幾十到成百上千個位 點；無需熒光標記，僅需合成普通引物，單個分析成本低；高靈活度，一張芯片上樣本和位 點檢測匹配可隨意選擇；分析所需樣本量少（IOng)，高靈敏度，檢測精度高，SNP檢測準確 率可達99. 9%。適合臨床常規(guī)基因檢測，進一步為臨床個體化合理用藥提供技術(shù)支撐。
【附圖說明】
[0027] 圖1為一個樣本一個反應(yīng)體系的基因分型圖；
[0028] 圖2為實施例1中rs6463247位點CC型分型圖；
[0029] 圖3為實施例1中rs6463247位點CT型分型圖；
[0030] 圖4為實施例1中rs6463247位點TT型分型圖；
[0031] 圖5為實施例1中rs7560138位點AA型分型圖；
[0032] 圖6為實施例1中rs7560138位點AG型分型圖；
[0033] 圖7為實施例1中rs7560138位點GG型分型圖。
【具體實施方式】
[0034] 本發(fā)明提供了一種同時測定人環(huán)孢素作用靶點基因多態(tài)性的方法，包括下列步 驟：
[0035] 步驟1 :提取外周血細胞樣本的基因組DNA，針對目的基因不同的突變位點設(shè)計篩 選引物；并組合成不同的PCR反應(yīng)體系進行多重PCR反應(yīng)；
[0036] 步驟2 :擴增的PCR產(chǎn)物SAP處理后，進行單堿基延伸反應(yīng)；
[0037] 步驟3 :進行芯片點樣后，用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜進行檢測；
[0038] 步驟4 :使用軟件分析檢測結(jié)果，獲得分型數(shù)據(jù)。
[0039] 本發(fā)明的一種同時測定環(huán)孢素作用靶點通路系列基因多個SNP位點多態(tài)性的方 法，即一種同時測定人環(huán)孢素作用靶點基因多態(tài)性的方法，具體通過以下步驟實現(xiàn)：
[0040] 1、人全血基因組DNA提取
[0041] 用DNA提取試劑盒提取全血基因組DNA，并調(diào)整濃度并調(diào)整濃度為10-100ng/ul。
[0042] 2、多重PCR反應(yīng)
[0043] 1)查找目的基因序列，針對突變位點，設(shè)計并合成PCR引物
[0044] 2)根據(jù)已抽提樣品編制384孔反應(yīng)表，注明每孔對應(yīng)的DNA樣品的編號，所用引 物。
[0045] 3)按表在384孔板各孔中分別加入1 μ L DNA模板，貼膜，2000rpm/10秒離心后備 用。
[0046] 4)按下表配制PCR反應(yīng)液：（以384個樣本為例）
[0047]
[0048] 注：以上384孔反應(yīng)液有4%過量。
[0049] 5)取一排12聯(lián)管，每孔加入配置好的PCR反應(yīng)液133 μ L，短暫離心后備用。
[0050] 6)用IOul排槍取12聯(lián)管中PCR反應(yīng)液4ul，加入已有IuL DNA的384孔板中，使 各孔終體積為5ul。
[0051] 7)將裝有5ul反應(yīng)液的384孔板短暫離心后放入PCR儀，運行名為"PCR"的反應(yīng)程 序。PCR反應(yīng)程序為：94°C 15min，45個循環(huán)（94°C 20sec，56°C 30sec，72°C lmin)，72°C 3min。
[0052] 8)PCR反應(yīng)程序結(jié)束后，將384孔板短暫離心后備用，可在4°C保存。
[0053] 3、SAP 處理
[0054] 1)配制SAP反應(yīng)液
[0055] 按以下表次序配制SAP反應(yīng)液（以384個樣本為例）
[0056]
[0057] 注：以上3