利用SNaPshot技術(shù)檢測綿羊FecB基因多態(tài)性的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子標(biāo)記檢測技術(shù)，具體地說，涉及一種利用SNaPshot技術(shù)檢測綿羊 FecB基因多態(tài)性的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 家畜的產(chǎn)仔數(shù)是經(jīng)濟(jì)價(jià)值十分巨大的數(shù)量性狀。對綿羊產(chǎn)羔數(shù)的選擇不僅受到性 別和年齡的限制，而且綿羊的產(chǎn)羔數(shù)是一個遺傳力很低的數(shù)量性狀，因此難以用常規(guī)的育 種技術(shù)來改良產(chǎn)羔數(shù)性狀。標(biāo)記輔助選擇能夠通過影響選擇的時間、選擇的強(qiáng)度和準(zhǔn)確性 而極大地提高這類低遺傳力性狀的選擇功效，而找到與這些數(shù)量性狀基因座相連鎖的分子 遺傳標(biāo)記，則是實(shí)現(xiàn)標(biāo)記輔助選擇的先決條件。
[0003] 上世紀(jì)50年代，Seears兄弟選育出一群可以生多胞胎的澳大利亞美利奴 (Booroola Merino, BM)，并報(bào)道這種產(chǎn)多胞胎的美利奴綿羊比其他群體的美利奴綿羊 產(chǎn)蓋數(shù)提高了 30%。該基因已被綿羊和山羊遺傳命名委員會定名為FecB(Fecundity Booroola)。Montgomery等用遺傳連鎖和微衛(wèi)星標(biāo)記定位的方法將FecB基因定位于 Booroola羊的第6號常染色體上。最終研宄者發(fā)現(xiàn)綿羊FecB的影響是由于骨形態(tài)發(fā)生蛋 白受體 lB(Bone morphogenetic protein receptor 1B，BMPR1B)基因編碼區(qū)發(fā)生了 A746G 突變，從而引起第249位氨基酸由谷氨酰胺變?yōu)榫彼幔≦249R)。1個FecB拷貝增加排卵 數(shù)1. 3-1. 6枚，母羊產(chǎn)羔數(shù)增加0. 9-1. 2只；2個FecB拷貝增加排卵數(shù)2. 7-3. 0枚，母羊產(chǎn) 羔數(shù)增加1. 1-1. 7只。
[0004] 由于FecB基因能提高綿羊繁殖力，可帶來巨大的經(jīng)濟(jì)利益，因此各地展開了對不 同綿羊品種FecB基因的檢測。目前研宄表明FecB突變存在于世界各地各種高繁殖力綿 羊品種中。我國的湖羊和小尾寒羊均攜帶此突變。傳統(tǒng)的FecB基因檢測方法，大多采用 PCR-RFLP(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism)和 PCR-SSCP(polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism)檢 測方法，這些方法通量較低，程序繁多，較難實(shí)現(xiàn)高通量自動化測定。
[0005] 單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism, SNP)主要指在基因組水平 上，由單個核苷酸變異引起的DNA序列多態(tài)性。是一種十分理想、有效的分子標(biāo)記。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種利用SNaPshot技術(shù)檢測綿羊FecB基因多態(tài)性的方法。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種檢測綿羊多胎主效基因 FecB基因型的方法， 其是對綿羊第6號染色體上第29382188bp位點(diǎn)（NC_019463. 1，基于綿羊基因組序列信息版 本號0ar_v3. 1，2012年12月）的核苷酸進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性檢測，根據(jù)檢測結(jié)果判定綿羊 FecB基因?yàn)锳A、AG或GG。本發(fā)明利用SNaPshot技術(shù)實(shí)現(xiàn)單核苷酸多態(tài)性檢測。
[0008] 本發(fā)明首先提供用于檢測綿羊FecB基因型的引物組合：
[0009] PCR擴(kuò)增引物的核苷酸序列如下：
[0010] 上游引物 F :5' -TTCAGATGGTGAAACAGATTGG-3'
[0011] 下游引物 R :5' -CAAGATGTTTTCATGCCTCATC-3'
[0012] 延伸引物的核苷酸序列如下：
[0013] Sl :5' -TTCCGAGAGACAGAAATATATC-3'
[0014] 本發(fā)明提供含有所述引物組合的用于SNaPshot技術(shù)檢測綿羊FecB基因型的試劑 盒。
[0015] 優(yōu)選地，所述試劑盒還包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反應(yīng)緩沖液、核酸外 切酶I和堿性磷酸酶等中的一種或多種。
[0016] 更優(yōu)選地，所述試劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)陽性模板。
[0017] 本發(fā)明提供的利用SNaPshot技術(shù)檢測綿羊FecB基因多態(tài)性的方法，包括以下步 驟：
[0018] 1)提取待測綿羊的基因組DNA ;
[0019] 2)以待測綿羊的基因組DNA為模板，利用所述引物組合中的引物F和R，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增反應(yīng)；
[0020] 3)用核酸外切酶I和堿性磷酸酶對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化；
[0021] 4)以純化后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，利用所述引物組合中的延伸引物進(jìn)行延伸反 應(yīng)；
[0022] 5)分析延伸產(chǎn)物，從而對綿羊FecB基因型進(jìn)行判定。
[0023] 其中，步驟2)中PCR擴(kuò)增反應(yīng)使用的反應(yīng)體系以15yL計(jì)為：100ng/yL基因 組 DNA lyL，10XPCR 反應(yīng)緩沖液 1.5yL，1.5mmol/L MgCl21.5yL，200 ymol/L dNTPs 0.3 4 1^，10(^111〇1/^1^上、下游引物各0.15 4 1^，2.5"4 1^了39 0嫩聚合酶0.3 4 1^，去離子水 補(bǔ)齊至15 μ L。
[0024] PCR 擴(kuò)增反應(yīng)的擴(kuò)增程序?yàn)椋?5°C 3min ;95°C 15s，56°C 15s，72°C 30s，35 個循環(huán)； 72°C 3min〇
[0025] 步驟3)中對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，使用的反應(yīng)體系以7 μ L計(jì)為：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 3 μ L，IOU/ μ L 酶 ExoI 0. 2 μ L，5U/ μ L 酶 FastAP 0. 8 μ L，酶 ExoI 緩沖液 0. 7 μ L，去離子水 補(bǔ)齊至7 μ L。
[0026] 反應(yīng)條件為：37°C 15min，80°C 15min。
[0027] 步驟4)中延伸反應(yīng)使用的反應(yīng)體系以6 μ L計(jì)為：純化后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物2 μ L， SNaPshot Mix試劑1 μ L，IOOpmol/ μ L延伸引物0. 1 μ L，去離子水補(bǔ)齊至6 μ L。
[0028] 延伸反應(yīng)條件為：96°C Imin ;96°C 10s，52°C 5s，60°C 30s，30 個循環(huán)。
[0029] 優(yōu)選地，本發(fā)明采用測序法分析延伸產(chǎn)物。
[0030] 本發(fā)明進(jìn)一步提供前述方法在綿羊分子標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用。
[0031] SNaPshot技術(shù)的基本原理為：首先使用引物擴(kuò)增目標(biāo)SNPs所在片段，在擴(kuò)增產(chǎn) 物中加入核酸外切酶I (Exo I)和堿性磷酸酶（FastAP)消化掉反應(yīng)體系中的引物序列和 剩余的dNTPs，然后以純化后的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，使用測序酶、雙脫氧核苷酸（ddNTPs)和 5'-端緊靠 SNP位點(diǎn)的延伸引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。最后使用測序儀和GeneScan等軟件進(jìn)行 基因分型和數(shù)據(jù)分析。根據(jù)測序結(jié)果判定綿羊FecB基因?yàn)锳A、AG或GG ;其中，單核苷酸多 態(tài)性檢測是針對綿羊第6號染色體上位于29382188bp位點(diǎn)的核苷酸。
[0032] 本發(fā)明提供的利用SNaPshot技術(shù)檢測綿羊FecB基因多態(tài)性的方法，該技術(shù)準(zhǔn)確 性高，檢測速度快，成本低廉，并且結(jié)果判讀更容易。利用本方法可對FecB基因的SNP位點(diǎn) 實(shí)現(xiàn)自動化檢測，通過對綿羊FecB基因型進(jìn)行選擇，可以將具有高產(chǎn)羔數(shù)性狀的GG純合子 個體保留下來，提高綿羊的繁殖力，在對綿羊進(jìn)行大規(guī)模分子育種中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
【附圖說明】
[0033] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中利用SNaPshot技術(shù)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳 檢測結(jié)果；其中，1為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，M為DNA Marker，從下至上依次為100bp，250bp，500bp ，750bp，lOOObp，2000bp。
[0034] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中利用SNaPshot技術(shù)對FecB基因的三種基因型，即GG、 AA和AG的檢測結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0035] 以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明， 實(shí)施例均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊（Sambrook J&Russell DW, Molecular cloning: a laboratory manual, 2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。
[0036] 實(shí)施例1利用SNaPshot技術(shù)檢測綿羊FecB基因多態(tài)性的方法
[0037] 1、實(shí)驗(yàn)材料
[0038] 選