本發(fā)明涉及一種基于dna合成銀納米團(tuán)簇(agncs/dna)的滾環(huán)擴(kuò)增分子信標(biāo)及其在dna和rna病毒檢測中的應(yīng)用，屬于醫(yī)學(xué)和分子診斷。

背景技術(shù)：

1、2019冠狀病毒病(coronavirus?disease?2019，covid-19)是由嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(severe?acute?respiratory?syndrome?coronavirus?2，sars-cov-2)感染引起的疾病。目前，基于病毒本身特性及其引起的宿主免疫反應(yīng)特性和動態(tài)發(fā)展規(guī)律，已開發(fā)多種針對rna病毒核酸、宿主血清抗原或抗體檢測等方法和技術(shù)，但是大規(guī)模臨床篩查依然主要依賴sars-cov-2病毒rna分子檢測(rasmi,y.,et?al.(2021).analytical?andbioanalytical?chemistry?413(16):4137-4159；yüce,m.,et?al.(2021).biosensors&bioelectronics?172:112752.)。為此，針對sars-cov-2rna的檢測也已發(fā)展多種新興檢測技術(shù)，如核酸等溫擴(kuò)增合并電化學(xué)傳感(chaibun,t.,et?al.(2021).naturecommunications?12(1):802.)、核酸分子機(jī)電系統(tǒng)傳感(wang,l.,et?al.(2022).naturebiomedical?engeneering.)、crispr-cas體系(clustered?regularly?interspaced?shortpalindromic?repeats/crispr?associated?nucleases)、(wang,y.,et?al.(2021).analytical?chemistry?93(7):3393-3402.)等，但由于這些技術(shù)或易受檢測樣本復(fù)雜環(huán)境介質(zhì)干擾，或依賴造價昂貴的新型檢測儀器和耗材，亦或檢測靈敏度或特異性不足，尚無法滿足臨床推廣應(yīng)用需求。目前，逆轉(zhuǎn)錄-定量聚合酶鏈反應(yīng)(reverse?transcriptionquantitative?polymerase?chain?reaction，rt-qpcr)作為sars-cov-2核酸檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”是covid-19臨床篩查和確診判定的最可靠手段(yüce,m.,et?al.(2021).biosensors&bioelectronics?172:112752；li,d.,et?al.(2020).theranostics?10(16):7150-7162.)。值得注意的是，商業(yè)化推廣的rt-qpcr檢測技術(shù)多以n、e、rdrp或orf1a/b為靶點(diǎn)，檢測時間～3h，較少關(guān)注變異株檢測，且存在假陰性風(fēng)險(yüce,m.,et?al.(2021).biosensors&bioelectronics?172:112752；sethuraman,n.,et?al.(2020).jama?323(22):2249-2251.)。因此，需要發(fā)展更為高效、快速且精準(zhǔn)的新型sars-cov-2病毒rna及其突變檢測方法。

2、人bk多瘤(bk?human?polyomaviruses，bkv)病毒是一種非包膜雙鏈dna病毒，其早在兒童時期就可以廣泛感染人群，并導(dǎo)致幾乎無臨床癥狀的持續(xù)感染(helle,f.,et?al.(2017).viruses?9(11):327.)。但是，bkv感染在免疫低下人群中會造成嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)及尿道病理性損傷(moret,h.,et?al.(2006).journal?of?clinical?microbiology?44(4):1305-1309.)。尤其需要注意的是，在腎移植過程中，由于機(jī)體細(xì)胞和體液免疫受損，bkv的大量復(fù)制會導(dǎo)致一定幾率的bkv病毒血癥，并可能再進(jìn)一步發(fā)展為bkv相關(guān)腎病(bkvassociated?nephropathy，bkvn)(gras,j.,et?al.(2023).transplant?infectiousdisease?25(2):e14012.)。已有報道指出尿液中bkv病毒載量可以預(yù)測bkvn發(fā)病風(fēng)險(randhawa,p.,et?al.(2004).journal?of?clinical?microbiology?42(3):1176-1180.)。因此，急需發(fā)展簡便快捷的尿液bkv病毒檢測方法?，F(xiàn)有檢測方法主要還是依賴于qpcr(moret,h.,et?al.(2006).journal?of?clinical?microbiology?44(4):1305-1309.)。新型的基于表面等離子共振(surface?plasmon?resonance,spr)生物傳感檢測面臨特異性不足，上樣量大等問題(su,l.-c.,et?al.(2014).journal?of?biomedical?optics?19(1):011013)。

3、近年來，隨著等溫擴(kuò)增技術(shù)的不斷發(fā)展，使得核酸分子檢測技術(shù)不再局限于聚合酶鏈反應(yīng)。而其中尤為引人注目的是滾環(huán)擴(kuò)增(rolling?circle?amplification，rca)。它是一種以小環(huán)形dna為模板連續(xù)滾動擴(kuò)增的等溫擴(kuò)增反應(yīng)，主要包括單引物啟動的線性擴(kuò)增(linear?rolling?circle?amplification，lrca)和雙引物啟動的超支化擴(kuò)增(hyperbranched?rolling?circle?amplification，hrca)(xu,l.,et?al.(2021).analytica?chimica?acta?1148.)。lrca一般需要先用線性掛鎖探針通過連接酶介導(dǎo)的連接反應(yīng)合成環(huán)狀探針，再以該環(huán)狀探針為模板在聚合酶和引物作用下進(jìn)行rca反應(yīng)，可在短短2～30min以內(nèi)生成以掛鎖探針為元件的成百上千的串聯(lián)重復(fù)長鏈核酸產(chǎn)物，擴(kuò)增速度達(dá)到53nt/s(lizardi,p.m.,et?al.(1998).nature?genetics?19(3):225-232.)。而hrca是在lrca基礎(chǔ)上再引入二級逆向引物，使原始微小環(huán)發(fā)生指數(shù)級擴(kuò)增(lizardi,p.m.,et?al.(1998).nature?genetics19(3):225-232.)。值得注意的是，rca尤其是lrca的待測靶標(biāo)可以是dna、rna、甚至小分子和細(xì)胞，既適用于液相檢測也可進(jìn)行可洗滌的固相檢測(yan,l.,et?al.(2014).molecular?biosystems?10(5):970-1003.)。同時，rca的信號輸出方式有多種，包括借助熒光分子或染料標(biāo)記的dntps或寡核酸探針，或者直接利用可以插入核酸的染料分子，以及運(yùn)用辣根過氧化酶標(biāo)記引起的顯色反應(yīng)，亦或熒光素酶或g4/血紅素-dna酶標(biāo)記誘導(dǎo)的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，甚或借助crispr/cas體系對taqman探針的切割作用等(xu,l.,etal.(2021).analytica?chimica?acta?1148；ali,m.m.,et?al.(2014).chemical?societyreviews?43(10):3324-3341.)。近來，通過利用啞鈴型探針提前合成環(huán)形模板，將靶標(biāo)特異性結(jié)合直接引入擴(kuò)增反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)了免連接反應(yīng)的一步法rca用于rna檢測(luo,n.,et?al.(2019).analytica?chimica?acta?1067:129-136.)。由于rca具有設(shè)計策略靈活可調(diào)、擴(kuò)增反應(yīng)快速、操作流程簡便、耐受樣本基質(zhì)干擾、兼容多種信號輸出模式等優(yōu)勢，已有大量研究成功將其應(yīng)用于單核苷酸多態(tài)性檢測和基因突變檢測(lizardi,p.m.,et?al.(1998).nature?genetics?19(3):225-232；steain,m.c.,et?al.(2009).antiviral?research?84(3):242-248；faruqi,a.f.,et?al.(2001).bmc?genomics2:4.)。此外，還有多家公司開發(fā)了基于rca的核酸診斷產(chǎn)品用于臨床相關(guān)dna和rna檢測(demidov,v.v.(2002).expertreview?of?molecular?diagnostics?2(6):542-548.)。但是，目前rca的各種信號輸出方式各有利弊，主要問題在于需要額外引入熒光分子、淬滅分子、染料或活性酶等，增加了反應(yīng)時間、步驟和成本，仍需要開發(fā)簡便、高效、可靠的rca新型分子信標(biāo)，并將其用于病毒核酸檢測。

4、dna合成銀納米團(tuán)簇(agncs/dna)有望成為rca的高效熒光分子信標(biāo)。agncs/dna作為由幾十個銀原子組裝形成的集合體，agncs/dna尺寸小于1nm，且合成步驟簡單、熒光可調(diào)，僅通過改變所用dna模板的長度、序列或結(jié)構(gòu)，就可實(shí)現(xiàn)對agncs光學(xué)性能的調(diào)控(zhou,z.,et?al.(2011).biosensors&bioelectronics?28(1):33-37；liu,j.(2014).tractrends?in?analytical?chemistry,58:99-111.)。加之，所用dna模板可根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則與靶核酸進(jìn)行雜交，具備直接的靶標(biāo)響應(yīng)性熒光調(diào)節(jié)性能，在核酸檢測中作為新型分子信標(biāo)優(yōu)勢顯著。近來，已發(fā)現(xiàn)agncs/dna具備富g臨近熒光增強(qiáng)效應(yīng)(obliosca,j.m.,etal.(2014).acs?nano?8(10):10150-10160；lin,r.y.,et?al.(2017).chemistry-aeuropean?journal?23(45):10893-10900.)，為其應(yīng)用于基于雜交的信號擴(kuò)增反應(yīng)奠定了基礎(chǔ)。其中，富g臨近熒光增強(qiáng)是以富含胞嘧啶c的dna序列為模板合成agncs，在其與帶有富含鳥嘌呤g序列垂懸端的互補(bǔ)鏈雜交后，由于富g序列與agncs靠近而使其產(chǎn)生熒光增強(qiáng)(yeh,h.-c.,et?al.(2010).nano?letters?10(8):3106-3110.)。申請人前期已利用富g臨近熒光增強(qiáng)效應(yīng)開發(fā)了發(fā)夾型dna合成銀納米團(tuán)簇agncs/hpdna，將其作為鏈取代等溫擴(kuò)增(strand?displacement?amplification,sda)的分子信標(biāo)并成功應(yīng)用于microrna檢測(zhang,j.,et?al.(2016).analytical?chemistry?88(2):1294-1302.)。此前也有其它報道將agncs/dna工程化，借助其熒光增強(qiáng)或淬滅或恢復(fù)性能，用于病毒dna或rna檢測(zhang,k.,et?al.(2016).rsc?advances?6(101):99269-99273；li,d.,et?al.(2021).acssensors?6(3):613-627.)。但是，尚未見agncs/dna結(jié)合等溫擴(kuò)增應(yīng)用于sars-cov-2核酸檢測的相關(guān)報道。將具有優(yōu)異熒光性能的agncs/dna與具有卓越的重復(fù)元件擴(kuò)增能力的lrca結(jié)合，有望為病毒核酸的快速、精準(zhǔn)、便捷、低成本體外檢測提供新型解決方案。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是：針對現(xiàn)有檢測技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種基于dna合成銀納米團(tuán)簇(agncs/dna)的滾環(huán)擴(kuò)增分子信標(biāo)及其在dna和rna病毒檢測中的應(yīng)用。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取了以下技術(shù)方案：

3、第一方面，本發(fā)明提供一種熒光分子信標(biāo)agncs/dt-gsp-t4，所述agncs/dt-gsp-t4為一種基于dna模板dt-gsp-t4合成的銀納米團(tuán)簇，其從5’到3’包含雜交區(qū)和銀納米團(tuán)簇(agncs，silver?nanoclusters)成核區(qū)，所述dna模板dt-gsp-t4的序列如seq?id?no.2所示。

4、優(yōu)選地，所述agncs/dt-gsp-t4的制備方法包括：將agno3和nabh4依次加入到含dt-gsp-t4的磷酸鹽緩沖液中震蕩反應(yīng)，所得溶液于暗環(huán)境中室溫下放置18h，即得。

5、優(yōu)選地，將agno3和nabh4依次加入到含dt-gsp-t4的磷酸鹽緩沖液中使得dt-gsp-t4、agno3、nabh4的終摩爾濃度之比分別為1:26:26。

6、優(yōu)選地，所述制備方法中制備原料配比為每制備1ml?agncs/dt-gsp-t4的原料配比如下：

7、

8、其中，nabh4需要新鮮配置，并在30s內(nèi)快速加入到ag+/dt-gsp-t4的混合液中，之后，劇烈震蕩～30s。所得溶液于暗環(huán)境中室溫下放置18～24h，即得agncs/dt-gsp-t4，4℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

9、第二方面，本發(fā)明提供第一方面所述的熒光分子信標(biāo)agncs/dt-gsp-t4在非診斷與治療目的地檢測dna和rna病毒中的應(yīng)用。

10、第三方面，本發(fā)明提供第一方面所述的熒光分子信標(biāo)agncs/dt-gsp-t4在制備用于檢測dna和rna病毒的試劑或試劑盒中的應(yīng)用。

11、優(yōu)選地，所述檢測通過滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)現(xiàn)，所述滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)借助能夠與待測靶標(biāo)特異性結(jié)合并含agncs/dna熒光增強(qiáng)富c序列區(qū)的掛鎖模板探針(padlock?probe，plp)，進(jìn)行無引物條件下的兩酶一步法(t4dna連接酶和phi29dna聚合酶)rca反應(yīng)，生成含富g序列串聯(lián)重復(fù)元件的單鏈dna，隨后，加入h2o2以消除rca反應(yīng)殘留dtt的影響，進(jìn)而以agncs/dt-gsp-t4為信號探針，在富g臨近熒光增強(qiáng)效應(yīng)作用下，對待測靶標(biāo)產(chǎn)生特異性熒光增強(qiáng)信號；其中，所述掛鎖模板探針設(shè)計需滿足5’端無頸環(huán)結(jié)構(gòu)，而3’端需要有頸環(huán)結(jié)構(gòu)，且該頸環(huán)位于agncs/dna增強(qiáng)區(qū)的3’端附近，進(jìn)而得到最優(yōu)rca-h2o2-agncs/dna檢測體系，實(shí)現(xiàn)最大熒光增強(qiáng)；

12、其中，所述兩酶一步法rca反應(yīng)采用的是t4dna連接酶和phi29dna聚合酶；所述待測靶標(biāo)為dna或rna病毒；所述含富g序列的串聯(lián)重復(fù)元件為(plp互補(bǔ)鏈)n，n≥1。

13、優(yōu)選地，所述檢測靶標(biāo)為sars-cov-2病毒n、e、orf1ab基因特定區(qū)域rna或bkv病毒vp2和vp3基因重疊區(qū)域的特定區(qū)域dna，所用的掛鎖模板探針為單掛鎖模板探針；其中：

14、靶序列為seq?id?no.10所示的nl?rna時，對應(yīng)的單掛鎖模板探針為seq?id?no.20的plp-nl4-s2a-np；

15、靶序列為seq?id?no.25所示的el?rna時，對應(yīng)的單掛鎖模板探針為seq?id?no.35的plp-ewl1m-np；

16、靶序列為seq?id?no.44所示的orf1abl?rna時，對應(yīng)的單掛鎖模板探針為seq?idno.48的plp-orf1ab-wl2m-a1-np；

17、靶序列為seq?id?no.55所示的vp23l時，對應(yīng)的單掛鎖模板探針為seq?id?no.59所示的plp-vp23l2-a2s-np；

18、所述單掛鎖模板探針從5’到3’依序?yàn)?’靶結(jié)合區(qū)、agncs/dt-gsp-t4雜交區(qū)、agncs/dt-gsp-t4熒光增強(qiáng)富c序列區(qū)、添加序列區(qū)(有或無)和3’靶結(jié)合區(qū)，且具有最優(yōu)熒光增強(qiáng)效應(yīng)的plp二級結(jié)構(gòu)滿足5’端無頸環(huán)結(jié)構(gòu)，尤其是信號探針雜交區(qū)catc附近無頸環(huán)，以保證agncs/dna的順利雜交；而在相應(yīng)的agncs/dna熒光增強(qiáng)區(qū)3’端形成頸環(huán)結(jié)構(gòu)，以達(dá)到最優(yōu)的熒光增強(qiáng)效應(yīng)。

19、優(yōu)選地，所述檢測靶標(biāo)為sars-cov-2病毒e或orf1ab基因特定區(qū)域rna，所用的掛鎖模板探針為雙掛鎖模板探針(plp-ud)；其中：

20、靶序列為seq?id?no.25的el?rna時，對應(yīng)的雙掛鎖模板探針分別是seq?idno.39所示的plp-ewl1m-np-u2和seq?id?no.40所示的plp-ewl1m-np-d2；

21、靶序列為seq?id?no.44所示的orf1abl?rna時，對應(yīng)的雙掛鎖模板探針為seq?idno.52所示的plp-orf1ab-wl2m-a1-np-u2和seq?id?no.53所示的plp-orf1ab-wl2m-a1-np-d2。

22、所述雙掛鎖模板探針從5’到3’依序?yàn)樯嫌伟薪Y(jié)合掛鎖探針plp-u和下游掛鎖探針plp-d，所述下游掛鎖探針plp-d依然含5’靶結(jié)合區(qū)、agncs/dt-gsp-t4雜交區(qū)、agncs/dt-gsp-t4熒光增強(qiáng)富c序列區(qū)、添加序列區(qū)(有或無)及3’靶結(jié)合區(qū)。

23、第四方面，本發(fā)明提供一種檢測試劑盒，包括本發(fā)明第一方面所述的熒光分子信標(biāo)agncs/dt-gsp-t4。

24、優(yōu)選地，所述檢測試劑盒中還包括單掛鎖模板探針或雙掛鎖模板探針，所述單掛鎖模板探針的序列為seq?id?no.20、35、48或59，所述雙掛鎖模板探針的序列為seq?idno.39-40或seq?id?no.52-53

25、第五方面，本發(fā)明提供一種用于非診斷與治療目的地檢測dna或rna病毒的方法，所述方法包括：兩酶一步法rca反應(yīng)的步驟和rca反應(yīng)產(chǎn)物在h2o2條件下與權(quán)利要求1所述的熒光分子信標(biāo)agncs/dt-gsp-t4進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)(rca-h2o2-agncs/dna反應(yīng))的步驟。

26、優(yōu)選地，所述rca反應(yīng)中每10μl的反應(yīng)體系組成如下：

27、連接反應(yīng)預(yù)混液(lm)?????1μl；

28、待測靶標(biāo)???????????????1μl；

29、rca反應(yīng)預(yù)混液(rm)8μl；

30、其中，5μl?lm組成為：

31、

32、8μl?rm組成為：

33、

34、其中，phi29dna聚合酶用10×op稀釋；

35、10×lta為自制連接反應(yīng)緩沖液，其成分為:

36、500mm?tris-hac；

37、100mm?mgac2和

38、10mm?atp；

39、10×pa為自制聚合酶反應(yīng)緩沖液，其成分為:

40、500mm?tris-hac；

41、100mm?mgac2和

42、100mm?nh4ac；

43、10×op為聚合酶原裝反應(yīng)緩沖液，其成分為：

44、500mm?tris-hcl

45、100mm?mgcl2

46、100mm(nh4)2so4和

47、40mm?dtt。

48、優(yōu)選地，所述兩酶一步法rca反應(yīng)的程序?yàn)椋?0℃，30min，4℃，forever。

49、優(yōu)選地，所述標(biāo)記反應(yīng)中每50μl的反應(yīng)體系組成如下：

50、rca反應(yīng)產(chǎn)物???????????????????????10μl；

51、0.1％?h2o2?????????????????????????0.846μl；

52、15μm?agncs/dt-gsp-t4??????????????40μl。

53、優(yōu)選地，所述反應(yīng)體系的配制方法為：在rca反應(yīng)產(chǎn)物中加入0.1％?h2o2后室溫靜置5min，隨后，再加入agncs/dt-gsp-t4，室溫再靜置5min。

54、優(yōu)選地，還包括對標(biāo)記反應(yīng)所得產(chǎn)物進(jìn)行熒光檢測的步驟：將rca-h2o2-agncs/dna反應(yīng)體系所得產(chǎn)物置于用于測熒光的微孔板中，于(cytation?5)多功能酶標(biāo)儀上進(jìn)行熒光發(fā)射光譜測定，得到熒光檢測信號。

55、優(yōu)選地，所述熒光發(fā)射光譜測定的條件為：激發(fā)波長λex＝540nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫為10nm，掃描步長1nm，取λex＝540nm/λem＝620nm處熒光強(qiáng)度值-作為病毒核酸檢測信號。

56、本發(fā)明建立了一種基于agncs/dna的無引物兩酶一步法rca-h2o2-agncs/dna反應(yīng)體系，在生成特異性串聯(lián)重復(fù)富g序列元件后，觸發(fā)agncs/dt-gsp-t4的富g臨近熒光增強(qiáng)效應(yīng)，并產(chǎn)生熒光增強(qiáng)信號，用于病毒核酸檢測。

57、本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下有益效果：

58、(1)本發(fā)明中rca反應(yīng)無需引物介導(dǎo)，相應(yīng)地，待測靶標(biāo)起到了引物作用，簡化了掛鎖探針plp的設(shè)計和實(shí)驗(yàn)操作步驟；

59、(2)相比現(xiàn)有的rca熒光染料特異性低的問題，基于agncs/dt-gsp-t4富g熒光增強(qiáng)效應(yīng)的新型熒光分子信標(biāo)具有高特異性，可以識別plp連接點(diǎn)處的單堿基錯配，而且通過增加plp連接點(diǎn)數(shù)目，形成上下游plp雙探針，可實(shí)現(xiàn)對雙突變位點(diǎn)的特異性識別；

60、(3)plp探針二級結(jié)構(gòu)是rca產(chǎn)物和agncs/dt-gsp-t4的熒光檢測信號的重要影響因素之一，在plp二級結(jié)構(gòu)滿足5’端無頸環(huán)結(jié)構(gòu)，而相應(yīng)agncs/dna熒光增強(qiáng)區(qū)3’端有頸環(huán)結(jié)構(gòu)時，可以得到最優(yōu)rca-h2o2-agncs/dna檢測體系，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)plp和agncs/dt-gsp-t4對輸出熒光信號的共同調(diào)節(jié)，進(jìn)一步提高檢測特異性。